培養步驟:

一、復蘇細(xi)胞:將含有(you)1mL細(xi)胞懸(xuan)液(ye)的(de)凍存(cun)管在37℃水浴中迅速搖晃解(jie)凍,加入5mL培養基混合(he)均勻(yun)。在1000RPM條件下離(li)心(xin)5分(fen)鐘,棄去上清液(ye),補加4-6mL培養基后(hou)(hou)吹勻(yun)。然后(hou)(hou)將所有(you)細(xi)胞懸(xuan)液(ye)加入培養瓶中培養過夜(ye)(或將細(xi)胞懸(xuan)液(ye)加入6cm皿中),培養過夜(ye)。每天換液(ye)并檢查細(xi)胞密度。

二、細(xi)(xi)胞(bao)傳代:如果細(xi)(xi)胞(bao)密(mi)度達80%-90%,即(ji)可進行傳代培養。

a)、對于貼壁細胞,傳代(dai)可參考以下方法:

1. 棄去培養上清(qing),用不含鈣(gai)、鎂離(li)子(zi)的PBS潤洗(xi)細胞1-2次。

2. 加1-2ml消(xiao)化(hua)液(ye)(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培(pei)養(yang)瓶中,置于37℃培(pei)養(yang)箱中消(xiao)化(hua)1-2min,然(ran)后(hou)在顯微鏡下(xia)觀(guan)察(cha)細(xi)胞(bao)消(xiao)化(hua)情(qing)況(kuang),若細(xi)胞(bao)大部分變圓(yuan)并脫落,迅速拿回(hui)操作臺,輕敲(qiao)幾下(xia)培(pei)養(yang)瓶后(hou)加5ml以(yi)上含10%血(xue)清的培(pei)養(yang)基終止(zhi)消(xiao)化(hua)。

3.輕(qing)輕(qing)吹打細(xi)胞,脫落(luo)后(hou)吸出(chu),在1000RPM條件(jian)下離心8-10分鐘(zhong),棄去上清(qing)液,補加(jia)1-2mL培養(yang)液后(hou)吹勻。

4. 按5-6ml/瓶(ping)補加培養液(ye)(ye),將細胞(bao)懸液(ye)(ye)按1:2的(de)比例(li)分到新的(de)含5-6 ml培養液(ye)(ye)的(de)新皿(min)中或者瓶(ping)中。

b)、對于懸浮細胞,傳代可參考以下方(fang)法:

方法一:收集(ji)細(xi)胞,1000RPM條件(jian)下離心8-10分(fen)鐘,棄上清液,補加1-2ml培養(yang)液后吹勻,將細(xi)胞懸液按1:2到(dao)1:5的(de)比(bi)例分(fen)到(dao)新的(de)含(han)8ml培養(yang)基(ji)的(de)新皿中或瓶中。

方法二(er):可選擇半(ban)數換液(ye)方式,棄半(ban)數培養基后,將剩余細胞懸(xuan)起,將細胞懸(xuan)液(ye)按1:2到(dao)1:3的比例分到(dao)新(xin)(xin)的含8ml培養基新(xin)(xin)皿中(zhong)或者瓶中(zhong)。

PS:若(ruo)客戶收(shou)(shou)到(dao)2ml小管(guan)(guan)細胞(bao)(bao)(bao)(bao),收(shou)(shou)到(dao)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)后(hou),用75%酒精噴灑整個管(guan)(guan)子消毒后(hou)放(fang)到(dao)超(chao)凈臺或(huo)安全柜(ju)內,嚴(yan)格(ge)無菌(jun)操(cao)作;將(jiang)小管(guan)(guan)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)轉移(yi)至T25培(pei)養(yang)瓶或(huo)6cm培(pei)養(yang)皿,加入5ml左(zuo)右培(pei)養(yang)基混勻,放(fang)入培(pei)養(yang)箱過(guo)(guo)夜培(pei)養(yang)后(hou)查(cha)看細胞(bao)(bao)(bao)(bao)密度(du):若(ruo)密度(du)未超(chao)過(guo)(guo)80%,換液(ye)繼續(xu)培(pei)養(yang),視情況傳代或(huo)者(zhe)凍存。若(ruo)密度(du)超(chao)過(guo)(guo)80%,可直(zhi)接(jie)進行傳代(方法同上)。

三、細(xi)胞凍存(cun):(注(zhu):無血清凍存(cun)液凍存(cun)細(xi)胞的方法

1、細胞生(sheng)長至覆(fu)蓋(gai)培養瓶的(de)80%面積時,棄25cm2培養瓶中的(de)培養液(ye),用PBS清洗細胞一次;

2、添加0.25%消化(hua)液約1ml至培(pei)(pei)養瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變(bian)圓后(hou)加入(ru)培(pei)(pei)養液終止消化(hua),輕(qing)輕(qing)吹(chui)打細胞使(shi)之(zhi)脫落,然后(hou)將懸液轉移至15ml離心管中,1000rpm離心5min;

3、用適量的凍(dong)存液重懸(xuan)細胞,并放置于(yu)凍(dong)存管中;

4、先將(jiang)細(xi)胞凍存管(guan)放置于(yu)-20℃ 1.5h,然后將(jiang)其(qi)移入-80℃